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重测序、转录组和甲基化贯穿分析
                                ——基因组印记研究

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目的:
分析杂交种子(F1)胚乳表达谱的亲源效应(母源表达或父源表达);
分析杂交种子(F1)胚乳和胚的甲基化差异以及甲基化的亲源效应;
分析亲源表达效应与甲基化的关系

研究概述和样本设计

研究概述:
将蓖麻两个品系(ZB107,ZB306)进行转录组测序,比较品系间SNP。分别对两品系正反杂交种子胚乳的F1(ZB306×ZB107)与F’1(ZB107×ZB306)进行测序,找出亲源特有的位点与基因,并进行了表达量分析与甲基化分析。
样本设计:

总体分析思路

1.胚乳印迹位点

研究方法:
对四个样本进行转录组重测序,将两个亲本进行比较,得到SNP信息。将正交与反交样本同样比较得到SNP信息,根据胚乳等位基因表达量的母本/父本的2倍关系,得到亲源特异的SNP,并进行了筛选。

所得结果:
杂合子中184个母系偏向表达SNP(178个基因),11个父系偏向表达SNP(9个基因),这些作为潜在的印迹区域。30个位于基因间区,22个为5’与3’UTR延伸,8个为新转录本(可能是lncRNA)。
61 (ZB107)与10 (ZB306)基因有大于90%的亲本偏向性。

区分不同亲源reads的原理

亲本特异表达基因分析

1)F1与F’1中基因在母本和父本来源基因的表达情况统计图。
2)图中各点代表得到潜在印迹基因,红色代表亲本特异表达的基因,蓝色代表非特异表达基因;红线与蓝线分别代表2:1与1:1的父/母本表达量比值的对数。

2.印迹位点的确认

研究方法:
将所有的母系偏向的经过筛选(偏向率超过95%,reads数超过100条)的基因,以及所有的父系偏向的基因找出,并进行了qPCR分析。

所得结果:
1)共57个印迹基因:51(全部58)个基因在母系等位基因中显著表达,6(全部9)个基因在父系等位基因中显著表达。这些基因的表达量均由qPCR结果进行了验证,结果与测序得到的一致。
经过确认,印记基因中大部分能在发育过程中保持最初表达模式,且超过一半不是胚乳特异表达。

3.印迹基因的分类

研究方法:
将得到的印迹基因进行cluster分析,以及功能分析,并进行了在各物种(拟南芥、水稻、玉米)的同源性比对。对印迹基因附近的转座子信息进行了分析。(证据显示:胚乳基因组中低甲基化区域与转座子有关。)

所得结果:
1)大部分印迹基因都没有聚类分布在基因组上,(除去三个位置上有2到3个基因相近),GO分析结果没有显著性富集的分类。
2)印迹基因在植物中同源性较差,仅有8个(拟南芥/蓖麻),5个(水稻/蓖麻),12个(玉米/蓖麻)印迹基因在所示物种中有同源基因。其中,仅有一个基因K domain gene 29765.m000727 (homologous to AT3G08620) 在四个物种中均有同源基因(RNA结合蛋白基因)。
3)转座子结果显示:在印迹基因附近有大量转座子富集,明显与拟南芥的DNA/MuDR以及玉米中的DNA/MuDR不同。

转座子分类图

全部杂合后代中,印迹基因与非印迹基因附近区域的转座子的分类比较。

4.胚乳甲基化分析

研究方法:
对胚乳及胚样本进行了甲基化测序(BS、30×),比较了胚与胚乳在基因区5’与3’端向外延伸2kb的区域及基因区的甲基化情况。2)对35DAF胚乳中亲本特异性甲基化率进行了分析。

所得结果:
1)印迹基因在胚乳中相对胚甲基化率较低,20个印迹基因在胚乳中特异低甲基化。在母源与父源表达比较方面,基因的印迹性与DNA甲基化相关(P<6.6e-6)。在胚与胚乳比较方面,除去两个胚乳优先表达基因外,印记基因的表达量与甲基化相关性不大。
2)找出了6个亲本特异性甲基化的印迹基因,均为母本中低甲基化而在父本中高甲基化,大部分印迹基因没有出现亲本特异性甲基化,说明甲基化可能只是基因印迹现象的部分原因。

胚乳与胚中基因及转座子甲基化率比较

35 DAF hybrid of ZB107×ZB306,胚(红色)与胚乳(蓝色)的各位置CG甲基化率水平(200bp为一个window),图中两段分别表示基因与转座子前2kb与基因后2kb,虚线代表基因与转座子的起止。

亮点
1)通过研究鉴别了蓖麻中大量的新印迹基因,通过系统分析植物印迹基因在进化过程的保守性发现了植物印迹基因具有很强的物种特异性。通过基因组的甲基化分析,发现了基因印迹的发生和DNA甲基化密切相关,说明DNA甲基化很可能是印迹基因发生的主要驱动力之一;
2)利用父母本差异SNP,实现对子代父源、母源等位基因表达和甲基化差异的分析;
3)对重测序、RNA-Seq与甲基化分析三者间进行了贯穿,一起解释基因印迹现象。

 

 

 

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