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一、文章来源

文章下载链接:/uploads/tmp/genedenovo-resume-1413439133.1232745.pdf

荔枝退化叶的转录组组装及活性氧胁迫导致的差异表达基因的找寻。周碧燕,华南农业大学。

二、背景

为了找到应对措施,了解荔枝花蕾发育背后的遗传学信息非常重要。
用Illumina RNA-seq构建了一个荔枝早期叶的参考转录组,为了弄清活性氧诱导的与叶衰老、脱落相关基因网络,用数字基因表达谱分析活性氧处理的早期叶转录组动态分析图谱。

背景:荔枝书属热带、亚热带广泛种植的常绿木本树。在全球变暖、气候变化时导致的开花缺陷对于荔枝生产是主要挑战。以前的研究已经表明,高温条件可促进花蕾中早期叶的生长并且抑制荔枝开花,而甲基紫精二氯化物(MV)诱导的活性氧可以促进早期叶的衰老、脱落。为了解活性氧在荔枝开花过程中的分子功能,对荔枝进行了转录组测序并从头进行组装。

三、结果:
组装得到 82036 unigenes,58%(47596)在Nr数据库中能找到高度相关的注释。
5223 unigenes 被发现在活性氧处理组与非处理组的早期叶中差异表达,并且与植物激素信号组分(如脱落酸和乙烯)相关的编码基因显著富集。

四、材料与方法

1. 材料与处理

生长于华南农业大学实验果园,13年树龄的荔枝经济种植品种。将新长出的约6cm长的树枝切下并立即放入水中。两小时后,将树枝用40μM的MV溶液处理。所有树枝放入20 ℃、160μmol/m2s1光量子通量密度的培养室中。

如图1A中第3和第4处的早期叶MV处理0小时,5小时,10小时后,进行取样,在液氮中冷冻并储存在-80℃用于RNA测序和定量qRT-PCR。
 

前期研究发现,早期叶衰老脱落的前期特征是出现向下生长的叶子。为证实MV的处理效果,将树枝用MV处理后,测量了3与4处的近端角α和远端角β。处理后近侧角α(如图1A)没有显著变化,而远端角β在处理后显著增大(表1)。这说明活性氧处理后能显示出早期叶衰老和脱落(图1B,C,D)的早期征兆。

2. 测序、De novo组装与注释

2.1 转录组组装结果

6-10个树枝混合叶作为一个样本,在0h、5h、10h每个样本两个重复。

为了得到荔枝早期叶的参考转录组,将6个测序的样本数据组装到一起

2.2 转录组注释结果

A:4个常用的蛋白数据库的注释结果
B:Nr数据库的注释情况
C:被注释到的unigenes物种情况

28,556 unigenes 大部分在4个物种中找到注释, 包括
Glycine max(大豆), Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula(苜蓿) 和Populus trichocarpa(毛果杨)

Unigenes的GO注释

23,278 unigenes 能够被GO数据库分成3类

Unigenes的KEGG注释


荔枝早期叶的13728个unigenes能够比对到KEGG的274条代谢通路中

6个DGE文库中reads覆盖度统计

不同的Reads覆盖种类的分布在6个文库中有相似的形式

重复实验可靠性验证
显示其方法上有很好的重复性

3. 基因的差异表达注释

以0h作为对照组,5h、10h作为处理组。
差异表达基因筛选条件: unigenes 符合 FDR ≤ 0.001 且 log2 Ratio ≥ 1
5223个unigenes被选出,认为有差异表达,并用来进行后续分析。

3.1 差异表达基因的GO分析

为查看5223个DEGs的表达趋势, 0h到10h的活性氧处理表达量数据归一化为0, log2 (υ5h/υ0h), log2 (υ10h/υ0h). 用STEM 软件将所有 DEGs 趋势分为8类。

显著DEGs(A-D) 的GO 分类

3.2 差异表达基因的KEGG富集分析

 28.6% (1,494/5,223) 的DEGs 能够被注释.
DEGs注释到的最有代表性的前10个KEGG代谢途径于表4中列出

植物激素信号转导
(ko04075),
淀粉和糖代谢(ko00500),
细胞周期(ko04110),
嘧啶代谢
(ko00240),
嘌呤代谢(ko00230),
植物病原相互作用(ko04626) 和
内质网途径的蛋白加工(ko04141).

3.3 与活性氧反应信号转导通路相关差异表达基因分析

3.4 KEGG中与植物激素信号传导通路相关的差异表达基因的表达量热图绘制

基因表达量数据被归一化为Z值

4. qRT-PCR验证差异表达基因

确认的转录组分析结果的准确性和再现性, 7个Unigenes被选定为实时定量逆转录聚合酶链反应(定量RT -PCR )验证

4.1 差异表达基因的qRT-PCR与RNA-seq的表达比较

通过qRT-PCR (左侧)和RNA-seq(右侧)显示候选的Unigene表达水平。定量qRT-PCR检测的数据是3个重复,RNA-seq的RPKM是两个重复的结果。

4.2 定量RT -PCR和RNA-seq之间的倍数变化的数据系数分析。

基因表达比率的倍数变化线性回归分析
RNA-seq 与 qRT-PCR显示显著正相关(图 6),证实了我们的转录组分析.

7个Unigenes被选定为定量RT - PCR检测。通过从RNA-seq( x轴)和定量RT-PCR ( y轴)的log2表达比生成散点图。

5.结论

1.我们的转录组数据可作为全面收集的荔枝叶片表达序列标签(ESTs),这是未来对荔枝等密切相关的物种的基因组学研究的重要资源。
2.已确定的差异表达基因还可提供潜在候选基因,用于圆锥花序的早期叶对照下,与荔枝开花过程相关的基因功能分析。

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