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文章总体分析路线,如下图:


这篇文章的巧妙严谨之处在于:

1. 这篇文章是研究赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)对花瓣发育互为相反的作用机制的,作者是怎么选材和设置激素处理时间点的呢?

首先作者每天用GA或ABA喷涂花絮一次,9日后收样,并测量花瓣长度。
结果显示GA显著促进了花瓣的延长,而ABA处理的花瓣比正常对照显著缩短,说明这两种激素在调控花的发育(大小)方面起着相反的作用。



然后作者用以上的方法同样处理离体的花瓣,并测量顶部、中部和基部三个部位的花瓣长度和细胞长度,结果显示GA处理组的三个部位的细胞长度都显著增长,而ABA处理组的细胞长度只在基部明显缩短。这些结果说明了花瓣延长与细胞延长有关,并且GA和ABA的相反作用只局限于基部位置。


然后作者用一种激素处理花瓣2h, 12h, 24h后,加入另一种激素,来研究GA和ABA的联合作用。发现这两种激素都能减弱对方的作用,并且ABA只在GA处理2h后显著减弱GA的增长效果,而GA在ABA处理2h和12h后都显著增长了花瓣长度,说明GA和ABA的效应是相反的,并且这些效应在12h后就不再显著。


基于这些结果,因此作者选择了激素处理2h和12h后的花瓣基部,来做RNA测序。


2. 找出差异表达基因后,作者是怎样挖掘出与GA和ABA促进和抑制作用相关的关键通路和基因呢?

因为GA和ABA这两种激素对非洲菊花瓣发育的作用是相反的,因此作者把差异基因(DEGs)分成三类,第Ⅰ类是GA或ABA处理2h比上正常对照(con vs GA2h, con vs ABA2h ),第Ⅱ类是GA或ABA处理12h比上处理2h(GA2h vs GA12h, ABA2h vs ABA12h),第Ⅲ类是GA或ABA处理12h比上正常对照(con vs GA12h, con vs ABA12h )。并统计了这三类DEGs在GA和ABA中表达模式相反的基因数目(GA-up, ABA-down,或GA-down, ABA-up)。


随后的GO功能富集分析也是按照这三大类DEGs来分别分析的:
在第Ⅲ类DEGs(12h)中,差异基因显著富集于“cell wall organization”这个GO条目中,特别是子类“cell wall loosening”,这些编码扩展蛋白的差异基因被GA激活,但被ABA抑制,而扩展蛋白被认为是细胞延长的分子标记。

在第Ⅱ类DEGs(12h/2h)中,差异基因富集于“凋亡”这个GO条目中,并且在GA中上调,在ABA中下调。这些基因编码了一组病原相关抗病蛋白,虽然GA和ABA可调节病原体引起的植物免疫应答,然而凋亡在GA/ABA调控的花瓣发育中到底起什么作用还需要更进一步的研究。

在第Ⅰ类DEGs(2h)中,差异基因显著富集于“转录调控”这个GO条目中,并且在GA中下调,在ABA中上调。这些差异基因包括了9个转录因子(TF)。

结合已有的报道和现有的数据,作者得出这些转录调控因子在非洲菊花瓣的细胞生长方面起着重要作用,GA处理后,TF被抑制,因此被TF抑制的与细胞壁松散、凋亡相关的基因得到表达,细胞得到延长;相反,ABA激活了TF,从而抑制了细胞延长。

然后,KEGG富集结果也不出意外的显示,差异表达基因在所有样本中都显著富集于植物激素信号通路(plant hormone signal transduction)。另外,多种激素相关信号通路也显著富集,如与赤霉素生物合成和代谢相关的双萜类生物合成通路(diterpenoid biosynthesis pathway)、与ABA生物合成和代谢相关的类胡萝卜素生物合成通路(carotenoid biosynthesis pathway),这与之前报道的非洲菊花瓣发育与一系列相互联系的激素信号通路有关的结论一致。

然后,作者将参与了GA和ABA合成、代谢和信号通路的DEGs作热图聚类分析,结果显示GA或ABA处理2h后,大部分DEGs显示出相反的表达模式,但处理12h后表达模式类似,表明了激素相关信号通路的转录调控在花发育过程中是早期的短暂的(下图D-G)。


小结

这篇文章是典型的植物发育转录调控分析的文章,有两点值得我们借鉴:
1. 实验设计与取材。作者通过一系列的预实验,证明了GA和ABA对花瓣发育起相反作用的位置是花瓣基部,并且在2h和12h比较显著。
2.如何从一大堆差异表达基因里面找出与研究相关的关键基因。就是要回归生物学意义,根据样本的特点,对差异基因进行分组分类。比如本文根据GA和ABA对花瓣发育的相反作用,把在GA和ABA处理组中呈相反表达趋势的基因分为一类,这样就使逻辑变得清晰,问题变得简单,并且更贴近于研究目的。

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