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苹果小RNA文献解读

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研究背景与目的
在黄土高原地区,绿苹果(Granny Smith)在成熟期摘袋复照后会变红,已有研究证明苹果皮中一些miRNA的表达受不同光照条件的影响。而苹果着色度是苹果品质的重要指标之一。为此,研究人人员发现并分析了果皮中miRNA在摘袋后复照过程中所起的作用。

目的:通过检测Granny Smith的小RNA找出导致摘袋复照后果皮变红的miRNA。


研究样品
西北农林科技大白水苹果研究所,6个Granny Smith混合苹果皮样本:
实验组:落花后第10d/40d套袋,于第120d/160d摘袋,摘袋后重新暴露于自然光照中,分别于摘袋后0h,6h,1d采摘。
对照组:未套袋和实验组来自同一颗果树,在自然光照下成熟并在相同时间采摘。(每组均为来自10棵苹果树的20颗苹果皮混样)

文章脉络

1、测序结果
    •建立了6个Granny Smith苹果皮sRNA数据库T1\T2\T3\N1\N2\N3
    •47%比对到苹果基因组,miRNA约占sRNA总数的8.5%,且长度分布合理。

2、miRNA的鉴定
    •分属43个苹果miRNA家族的201条miRNA序列被检测到。
    •其中miR156、miR171、miR172家族所占比例最多。
    •已有研究证明在苹果树中大量积累的MIR477、MIR482、MIR3627在苹果皮中也发现被大量积累。
    •比对苹果基因组参考序列、non-coding rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs、miRBase后得到220个新miRNA。

3.1、差异表达miRNA分析(组间)
套袋和不套袋组间比较后
•共发现属于54个miRNA家族的126个miRNA差异表达。
•说明:套袋前后,Granny Smith苹果皮中部分miRNA差异表达。

3.1、差异表达miRNA分析(组内)
套袋后不同复照时长组比较后
•发现T1、T2组中有24个miRNA差异表达。
•上述结果说明,套袋后光照时间长短会影响苹果皮中部分miRNA的表达水平,不同光照条件可以调节一些miRNA的表达。
•那么这些miRNA作用于哪些靶基因?这些靶基因又是否对苹果皮变红有影响呢?研究人员又进行了靶基因预测和功能通路富集分析。


3.2、差异表达miRNA的靶基因预测
•从已知miRNA中获得1334个目标mRNA,从新miRNA中获得1055个目标mRNA。
•筛选出套袋和未套袋组间差异表达的miRNA靶基因进行GO、KEGG富集分析,对靶基因功能进行预测。

•通过GO功能富集分析,发现差异表达的关键miRNA的靶基因功能多存在于花青素合成代谢等细胞进程、代谢进行和刺激应答过程。
如miR156:靶基因为转录因子MdSPL,受紫外线辐射调解;
miR828:靶基因为转录因子MdbHLH ,参与花青素合成代谢调控
miR858:靶基因为转录因子MdMYB9,参与花青素合成代谢调控; 
•通过KEGG通路富集分析,发现关键miRNA的靶基因都属于苹果皮的抗氧化通路, 类黄酮生物合成,花生四烯酸代谢,谷胱甘肽过氧物酶代谢等。其中类黄酮生物合成已被证明对植物抗UV辐射起关键作用。
•靶基因功能分析说明,摘袋后果皮变色是Granny Smith为了应对环境压力的一种光保护作用,而花青素的累积增多,就是最显著的表现。

4、 qRT-PCR验证

•试验中套袋组果皮中花青素含量极低,摘袋后均上升。
•qRT-PCR检测miRNA和对应的靶基因表达量发现3种miRNA:miR156、 miR828、miR858共同作用调控GrannySmith中花青素合成积累。


研究结果
•发现已知miRNA201个,novel miRNA220个。
•套袋和未套袋果皮中存在差异表达的miRNA,且它们的靶基因多参与调控花青素合成代谢。
•找出3种与Granny Smith果皮中花青素合成代谢相关的miRNA: mi156、miR828、miR858

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