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不同品系小白菜镉胁迫转录组比较分析

合作老师:中山大学 周倩博士

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研究背景
土壤中重金属含量对植物、人类健康产生的环境危害问题愈发严重。
植物叶组织中的Cd来源于根组织,根部Cd耐受程度决定叶中Cd含量高低。
不同品系小白菜对Cd吸收及累积能力有明显差异。
前期研究证明,高镉积累品系(HAJS)小白菜的细胞壁、叶绿体、组织溶酶体中Cd含量均高于低镉累积品系(LAJK)
但转录水平差异及调控原理尚不清晰。

研究目的
研究基因水平上,不同处理时长、不同品系(高镉累积和低镉累积品系)小白菜对镉胁迫应答反应的差异。
研究两种品系对镉吸收累积能力的差别是由哪些遗传基础决定的。

研究思路

分组进行趋势分析
1.在同一品系中,不同处理间进行趋势分析, 发现各品系在Cd刺激过程基因表达模式差异;
2.比较不同品系间,显著趋势间的差异,推测两品系应答速度、主要GO term,pathway的差异;
3.比较不同品系间,相同处理下的差异,推测参与完整应答反应过程并造成品系间差异的关键基因。

一、基础研究
1.发现差异

前期实验中,作者通过对两种品系小白菜受Cd刺激后连续多个时间点根部Cd浓度的检测发现两种品系间存在显著差异,其中关键时间点包括:

未经Cd处理组(T0)两品系中检测出的Cd浓度无差异;
Cd处理3h后(T3)HAJS组Cd浓度是LAJK组2.9倍;
Cd处理23h后(T24)HAJS组Cd浓度也显著高于LAJK组(P<0.01)

 

为研究转录水平上两种品系产生Cd累积差异的原因,作者对两品系未受Cd刺激及Cd刺激后3h、24h的根部组织进行了RNA-seq。

二、转录组分析

对6组Mixed RNA测序结果进行过滤、拼接组装后得到参考序列,再将HAJS和LAJK两品系的测序结果与参考序列进行比对得到两品系转录组。
再分别对两品系内不同处理间的结果进行比对分析后找出处理间的差异表达基因(DEGs)。

结果显示,两种品系间的DEGs数量差异显著,各处理间不伦上调或下调,HAJS品系中的差异基因数量都显著高于LAJK品系。
表明相对LAJK品系,HAJS品系对Cd刺激的应答反应更“迅猛”。

三、品系内DEGs趋势分析

获得DEGs后,分别对各品系内所有的DEGs进行趋势分析,各得到3种Cd应答过程中产生的显著趋势。
通过对两个品系间显著趋势的比较发现:

四、功能富集分析
随后作者又分别对不同品系各显著趋势中的DEGs进行GO功能富集分析。

HAJS品系中,Cd刺激应答过程显著富集的基因包含于细胞壁合成、谷胱甘肽合成、热休克蛋白合成(HSPs, 起维持蛋白质稳定性,在重金属胁迫中保护植物细胞作用)、糖代谢等GO term中。

LAJK品系中,Cd刺激应答过程显著富集的基因包含于DNA合成修复、脱落酸代谢合成、含氧化合物反应等GO term中。
上述结果进一步表明,HAJS品系小白菜不仅对Cd刺激早期应答反应速度更快,且两品系参与应答反应的主要功能基因不同。

五、qPCR验证

随机挑选8个不同表达模式的基因进行qPCR检测,对RNA-seq结果进行验证。结果显示与测序数据相关性良好。(r=0.683,P<0.0001)

六、Cd积累相关通路分析
接着,作者又对对不同品系中,显著趋势中的DEGs进行pathway分析,发现三条重要通路。

1.细胞壁合成通路增强导致高镉累积型(HAJS)小白菜表现出高Cd耐受
HAJS小白菜对Cd胁迫应答反应中,谷胱甘肽(GSH)与Cd结合过程起主要作用,而HAJS型小白菜中Cd的高累积量与植物螯合物(PC)的转移密切相关。

2.解旋酶合成增强LAJK在转录水平对早期Cd胁迫的应答反应敏感性
在LAJK小白菜中,Cd刺激后3h大量表达并注释到核糖体形成、DNA复制通路的基因大部分属于解旋酶(Helicase)合成过程,而酶催化是DNA合成的第一步,所以,Cd释放后早期应答与DNA合成修复相关基因有关。低剂量Cd刺激可以诱导增强DNA复制,从而抵抗Cd胁迫。

3.脱落酸(ABA)诱导的抗氧化信号转导通路是区分两种品系差异的关键
ABA信号转导通路中,LAJK中编码PYR/PYL(脱落酸受体复合体)上调,抑制SnRK2s蛋白的基因并从中释放PP2Cs基因最终影响具有调节渗透压功能的DREB2A基因,抑制Cd积累。但在HAJS中,这条通路被抑制。  

七、品系间差异分析
最后,对不同品系间,相同处理条件下的基因进行差异分析,找出DEGs,并进行功能富集分析。

Cd在植物体内是通过阳离子转运进入细胞内,而Cd转运相关基因在Cd累积过程扮演重要角色,由此,进一步筛选出Cd转运相关的93个DEGs,进行分析。

分析发现,96个DEGs中中参与编码Cd排放基因PDR8的基因仅在LAJK中大量表达,导致LAJK品系小白菜根部Cd吸收能力及Cd积累能力低;

而参与编码Cd吸收转运基因YSL1的基因仅在HAJS中大量表达,导致HAJS品系小白菜根部对Cd高耐。

结  果
1.相对LAJK品系HAJS品系对Cd胁迫应答反应产生更快。Cd在小白菜中累积能力与转录水平Cd胁迫应答反应速度有关。
2. 功能富集分析表明HAJS品系中调控细胞壁合成、谷胱甘肽(GSH)合成代谢的基因也参与了Cd胁迫应答反应;LAJK品系中则主要是调控DNA修复和脱落酸(ABA)信号转导通路的基因参与Cd胁迫应答。
3. 参与Cd排放的基因PDR8在LAJK品系大量表达;负责Cd转运的基因YSL1在HAJS中表达量增多,表明在LAJK和HAJS两种品系中Cd转运机制不同,从而导致Cd自然累积能力差异。

文章数据挖掘特点

比较两组样本趋势变化差异, 推断不同品系应答模式的快慢;
从差异趋势中,找出差异的pathway或 GO term,证明不同品系Cd应答通路的差异;
结合以上结果,比较不同品系在相同处理下的基因表达差异,结合功能富集分析,挖掘出不同品系产生Cd应答反应差异的关键基因。

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