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蓖麻胚乳型种子基因组DNA甲基化

合作老师:昆明植物所  徐伟教授

文章下载链接:/uploads/tmp/genedenovo-resume-1467594249.6691309.pdf

本文的研究目的是了解甲基化对印记基因的影响。但在实际研究过程中,解释完研究问题后,却发现了TE上存在着“奇怪”的甲基化现象。

总体分析思路

蓖麻籽胚和胚乳的DNA甲基化图谱比较

研究目的
揭示蓖麻种子基因组甲基化模式
研究蓖麻种子DNA甲基化与基因表达的关系
解释蓖麻胚乳特有CHH甲基化模式的形成机制

实验思路

测序路线

背景资料—植物甲基化类型及相应甲基化相关酶
植物甲基化类型:CG,CHG,CHH
植物甲基化相关酶分类表

1.参与甲基化的基因鉴定及组织特异性表达分析
实验方法
以拟南芥为参考,通过氨基酸系列及结构域分析,找出蓖麻种子中与甲基化相关的基因(甲基化酶和去甲基化酶)。
然后利用qRT-PCR分析这些甲基化相关基因在根,茎,叶,胚,胚乳等多个组织的表达情况。

实验结果
通过生物信息学分析发现蓖麻的8个甲基化酶:RcMET1-1,RcMET1-2,RcCMT1,RcCMT2,RcDRM1,RcDRM2,RcDRM3,RcDnmt2,和3个去甲基化酶:RcDME, RcROS1和RcDML3。
qPT-PCR结果显示这些甲基化关联酶在胚和胚乳不同发育阶段的表达模式不一样,这预示着在种子的不同发育时期,胚和胚乳的甲基化水平有可能成动态变化。

组织特异表达甲基化基因


各甲基化关联基因在蓖麻不同组织的表达情况
图中纵坐标表示基因表达量,横坐标表示不同植物组织(以不同颜色表示)。

2. BS测序鉴定蓖麻特有甲基化模式
实验方法
收集35DAF蓖麻种子,分别对胚和胚乳进行BS测序。
然后通过对比其他物种的甲基化模式分析蓖麻特有甲基化模式。
分析蓖麻自身CG,CHG,CHH三种甲基化状态,了解不同甲基化类型组成情况。

实验结果
相比于其他植物高比例CG甲基化,蓖麻种子有较高比例的CHH甲基化状态(达到68%)
相比于胚,胚乳表现出低CG和CHG甲基化,而CHH的甲基化水平几乎不变
相比于胚,胚乳基因区的CG,CHG,CHH及TE区的CG,CHG都显示低甲基化,唯独TE区CHH显示高甲基化

蓖麻种子CHH甲基化具有物种特异性
 


各物种胚和胚乳的甲基化组成分布比较
图中纵坐标表示各种甲基化类型所占有比例,横坐标表示各物种的胚和胚乳。其中em表示胚,En表示胚乳。

相对稳定的CHH甲基化

表中表示蓖麻种子胚和胚乳的CG,CHG,CHH三种甲基化水平比较,相比于胚,胚乳的CG及CHG明显处于较低甲基化水平,但CHH的却没有明显变化。

胚乳TE区高甲基化CHH


不同甲基化类型在胚和胚乳不同区域的分布状态

图A从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和胚乳(蓝线)的基因区域分布状态。
图B从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和胚乳(蓝线)的TE区域分布状态。
其中,横坐标表示基因或TE上下游区域长度,纵坐标表示甲基化水平

3. 差异甲基化(DMRs)分析

实验方法
通过胚和胚乳的甲基化基因位点相减之后,筛选(1.对于CG和CHG,胚和胚乳两者间有>40%差异,其中一个甲基化水平不低于60%。2.对于CHH,有>20%差异性,其中一个甲基化水平不低于40%)出有效的DMRs。


实验结果
发现20464个CG和25940个CHG的DMRs,其中99.9%在胚乳中都属于低甲基化。同时发现2727个CHH的DMRs,其中只有55.9%在胚乳中表现出低甲基化。
相比于胚,胚乳的甲基化率更低(99.9%CG和CHG的DMRs,及55.9%CHH的DMRs),这与甲基化酶CMT和MET在胚的激活相关。

胚乳表现出低甲基化


表中表示各类型DMRs在胚和胚乳中的比较情况。

上表显示,相比于胚,胚乳的总体甲基化率较低。但有趣的是,CHH在胚乳中的甲基化水平与胚相当。

4. DNA甲基化负调控基因表达

实验方法
通过下载数据库,找出胚和胚乳的差异表达基因;
将DMRs与差异表达基因进行位置关联(比对到基因区域及基因上下游2kb区域)分析,解释DNA甲基化与基因表达的关系;
通过qPCR验证结果。

实验结果
低表达基因的上下游及基因区域都有高甲基化的CHG和CHH,表示甲基化在一定程度上抑制胚的基因表达。
相比于胚,胚乳中高表达的基因都表现出5’, 基因区, 3’的CG和CHG低甲基化。这同样证明DNA甲基化与基因表达的负相关关系。
挑选28629.m000565和30093.m000370两个在胚乳高甲基化的基因进行qPCR,发现其表达水平与甲基化水平呈负相关。

基因表达水平与甲基化水平呈负相关


图B表示基因28629.m000565在胚乳及胚中的甲基化比较,图C是基因在胚乳和胚的表达量比较
通过基因甲基化和表达量的关联分析,明显看出胚乳中DNA甲基化水平与基因表达量呈负相关关系

5. siRNA表达与DNA甲基化相关
实验方法
对胚和胚乳进行small RNA测序
关联small RNA测序数据与BS数据,筛选24-nt siRNA,分析其与三种甲基化类型的位置及丰度相关性,从而解释siRNA与DNA甲基化的关系。

实验结果
被24-nt siRNA覆盖的区域显示出高CHG和CHH甲基化,表示siRNA与DNA甲基化相关。
与胚相比,5个胚乳中参与RdDM的基因的低表达,证明RdDM与DNA甲基化有关。
胚乳中,基因区域以及TE区域的siRNA覆盖度都与CHH的甲基化水平呈正相关,表示胚乳中高丰度的CHH与siRNA介导的RdDM有关。

siRNA介导RdDM调控CHH甲基化


图示siRNA覆盖度影响胚和胚乳的DNA甲基化水平
横坐标表示胚和胚乳中不同甲基化程度(高和低)的区域,纵坐标表示24-nt siRNA丰度

本文亮点

发现蓖麻特异性的胚乳高CHH与siRNA的关系
(有趣的线:1.胚乳有高丰度siRNA—2.胚乳TE的CHH高甲基化—3.抵消CMT在胚乳低活性—4.胚乳CHH甲基化状态变化不大)


通过转录组测序,甲基化测序及small RNA测序的多组学分析,揭示蓖麻种子DNA甲基化负调控基因表达,以及siRNA可调控CHH甲基化状态。

分别3个生物学重复的胚和胚乳small RNA测序:分别提取胚及胚乳的total RNA,凝胶电泳后切除16-30nt的片段进行后续建库测序。去除rRNA,tRNA等原始数据,对clean data比对到蓖麻基因组中进行分析。

测序路线


 

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