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泛素化介导花瓣衰老机制研究

 

合作老师:华南农业大学  余义勋
发表期刊:《Plant Physiology》     IF:6.28

文章下载链接:/uploads/tmp/genedenovo-resume-1492570663.8373396.pdf

植物花瓣生命周期短,因此是衰老研究的重要材料。衰老(凋谢)是一个非常复杂的过程,它在mRNA、蛋白以及翻译后修饰等多个水平受到调控,其中蛋白质大量降解是衰老的重要标记。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它能够促进蛋白质降解,因此泛素化被认为与衰老有关。

另一方面,已有研究表明,乙烯能够通过调节转录后修饰介导的蛋白降解参与到花瓣凋谢当中,但其机制还不明确。因此,本研究以矮牵牛花瓣为材料,通过转录组、蛋白组和蛋白质泛素化修饰组学分析,研究乙烯对花瓣衰老过程的影响机制。


实验取材
取16小时乙烯处理(实验组)和空气处理(对照组)各三个重复的花冠组织进行转录组测序、蛋白组以及泛素组质谱分析。

研究思路
文章主要通过蛋白组与泛素化组,辅助以转录组的方法开展研究(图1)。


图1 文章研究思路

结果解读
1、乙烯加速花瓣凋谢
在乙烯处理后16h,矮牵牛花冠裂片开始内卷,并且伴有透明小点出现,表明花瓣开始凋谢(图2A)。在处理后32h,无论是花冠干重(图2B)还是蛋白含量(图2C)都明显降低。这些结果都表明乙烯加速了花瓣凋谢。


图2 乙烯对花冠影响
(A:上面为乙烯处理组,下面为未处理对照组;B、C:蓝色为对照组,红色为处理组)

2、乙烯引起花瓣转录、蛋白和泛素化组改变
由于花瓣衰老在mRNA、蛋白以及翻译后修饰三个层面都有密切关系,因此作者分别通过转录组、蛋白组以及泛素化组同时研究乙烯对花瓣衰老的影响:

①首先,在转录组层面,利用根茎叶花等八个组织构建参考基因组后,通过转录组测序分析发现16小时的乙烯处理引起花瓣的14448个基因表达下调,6303个基因表达上调。qRT-PCR验证了其中的基因(图3),KEGG注释表明这些差异基因主要与植物激素信号转导等22条通路相关。

②然后,在蛋白水平,通过质谱分析发现了个3606个蛋白,其中上调的有233个、下调为284个。GO注释发现这些蛋白与杂环分解代谢过程等功能相关。

③最后,在翻译后水平,也就是泛素化组(Ubiquitylome)进行研究。通过抗体富集以及质谱研究,精确地发现了2270个赖氨酸泛素化位点(Kub),其中乙烯处理后上调位点有320个,下调的则有127个。这些结果显示乙烯处理增加了花冠泛素化水平。KEGG注释表明这些正经历泛素化的蛋白参与到剪接体、RNA转运等多个通路当中(图4)。


图3 转录组与qRT-PCR检测差异表达基因情况


图4.具有差异Kub位点的蛋白功能注释
(A:上调、B:下调)和KEGG注释(C:上调、D:下调)

3、转录本数量与蛋白存在一定正相关性
以显著差异上、下调转录本为对象,对比对应的蛋白表达数据发现,上调转录本与对应蛋白存在一定相关性(r =0.49),而下调转录本则基本与蛋白数量难以产生联系(r=0.08)。同理,以显著上、下调蛋白为对象,对比对应转录本也发现上调部分有较高正相关(r=0.53),下调部分相关性较弱(r=0.21)。这可以预期到翻译后修饰有可能参与到蛋白调控当中,从而引起转录本与对应蛋白数量没有完全正相关。


图5 转录本与蛋白表达相关性
(A:所有差异转录本vs所有差异蛋白、B:上调转录本vs对应蛋白、C:下调转录本vs对应蛋白、D:上调蛋白vs对应转录本、E:下调蛋白vs对应转录本)

4、蛋白组与泛素化组存在负相关性
由于之前假设,乙烯处理能够引起泛素化的上调,从而导致蛋白的大量降解,因此下一步则研究花冠的蛋白组与泛素组之间的关系。通过蛋白组与泛素化组的关联分析,可以发现存在泛素化位点的蛋白共有1121个,其中985个正在经历泛素化作用。通过对蛋白质总体表达水平和泛素化修饰蛋白数量进行比较,发现无论整体(图4A)还是从上下调的蛋白(图4 B、C)以及泛素化蛋白(图4D、E)开始进行比较,蛋白组与泛素化组之间存在负相关性。表示泛素化与蛋白降解有关。


图6 总蛋白表达与泛素化位点蛋白相关性
(A:所有差异转录本vs所有具有泛素化位点差异蛋白(r=-0.38);B:上调蛋白vs对应泛素化位点(r=-0.51);C:下调蛋白vs对应泛素化位点(r=-0.4);D:上调位点vs对应蛋白(r=-0.32);E:下调位点vs对应蛋白(r=-0.25);F:整体统计)

5、泛素化参与乙烯引起的蛋白降解
数据不单证明蛋白与泛素化位点成负相关,而且进一步发现,乙烯处理能够促进参与泛素化的蛋白的表达,从而引起蛋白大量降解。在转录组数据中,发现229个与泛素化相关的unigene在乙烯处理后发生上调。而蛋白组数据则发现4个蛋白在处理后发生上调。同时,在发生泛素化上调的蛋白当中,有44个的表达下调,只有8个上调。

这表明乙烯处理后,参与泛素化的基因和蛋白(如E3 ubiquitin-protein ligases)都大量表达,这些泛素化蛋白的表达最终引起其他蛋白产生泛素化,从而导致总体蛋白的大量降解。最后,KEGG分析发现,这些在蛋白和泛素化水平有相反趋势的蛋白主要参与到黄酮类物质合成、苯丙脂类代谢等通路当中。

6、乙烯通过多个途径引起花瓣凋谢
最后,综合转录组、蛋白组以及泛素化组的数据,作者详细地对乙烯引起花瓣凋谢的多条通路进行详细解释。乙烯诱导了以下与衰老相关的通路改变:

①转录组和蛋白组数据都显示,乙烯诱导了非泛素依赖降解酶的上升:如半胱氨酸降解酶、丝氨酸降解酶等。

②乙烯促进了与自噬作用相关蛋白的上调:如自噬蛋白PhATG8。

③乙烯处理影响植物激素合成和信号传导途径(图7):乙烯处理后,SAM合成酶(乙烯生物合成的关键酶)的泛素化位点大量上升,引起蛋白的数目下降,然而另一个乙烯合成关键酶ACO由于去泛素化作用而出现上调。这些证据表明乙烯处理影响生物体内部的乙烯合成与其他激素的合成,如ABA、生长素等。

④最后,作者还发现了乙烯促进蔗糖合成和运输、阻碍苯环类以及苯丙脂类挥发性物质的合成、减缓氨基酸合成等。这些发现都有助于了解乙烯如何影响花瓣生命周期。


图6 乙烯影响乙烯生物合成和信号传导示意图

文章小结
本文结合转录组、蛋白组与泛素化多个组学,在mRNA水平、蛋白水平以及翻译后修饰水平深入研究花瓣的衰老机制。对大量衰老相关蛋白在衰老过程中泛素化修饰水平和蛋白质水平上的变化进行了重点分析,获得了大量新的蛋白质泛素化修饰位点,从蛋白质泛素化修饰这一角度对花瓣衰老进行了新的诠释。

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